실험레포트 생물실험레포트

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본문 생 물 실 험 - P C R -전 기 영 동 - Ligation (예비) 생물실험 예비 리포트 -실험주제: Ligation -실험 목적: Ligation은 문자 그대로 DNA나 RNA의 끝을 이어주는 과정을 가리키는 용어이다. -실험도구(예상) 재조합할 DNA (Insert : Gel band에서 추출, Vector : EcoR1 & BamH1으로 잘라낸 PBS II),Recombinant DNA를 Electrophoresis 하기 위한 Gel과 Loading dye, Loading Buffer, Enzyme, Miniprep을 하기 위한 PGFP + GST (PGEX)의 플라스미드를 가진 박테리아 cell 표본, ransformation을 시키는데 필요한 박테리아(E.coli), 그밖의 기본적인 실험도구들 : 마이크로피펫 (20㎕~200㎕), 15㎖ tube, micro-tube, 메스실린더, 비커 등 -실험이론: Ligase가 DNA를 붙인다는 것은 DNA 끊어진 부분 즉 5인산과 3OH를 연결하는 것을 말한다. 말단의 경우 조건을 약간 달리하면(낮은 온도, 높은 효소농도, 오랜 시간) 붙일 수 있지만 돌출된 단일가닥의 DNA가 달라붙지 않는 경우, 즉 예를 들어 서로 다른 효소 등으로 잘려 염기간의 상보적 결합이 없는 돌출되어있는 구조를 보이는 경우, Ligase가 작용할 가능성은 거의 없다. Ligase가 작용하기 위해서는 위에서 말한 끊어진 두 가닥의 5말단과 3말단이 만나야 한다. naver 참고)1. 실험에 사용할 vector와 insert를 준비한다. 물론 vector와 insert는 끝이 같은 모양을 하고 있어야 한다. 즉 같은 제한효소에 의해 절단되어 같은 조각을 이루고 있어야 한다. 2. Vector와 insert의 몰비(molar ratio)가 1:2를 이루도록 eppen drof에 혼합하여 담는다. * 일반적으로 vector의 크기 1 kb당 50~100 ng의 양이면 vector의 양은 충분하며 insert는 크기에 따라 vector와 몰비를 고려하여 혼합한다. 몰비는 실험자에 따라서 1:1(equimolar)에서 1:4까지도 쓰며 특수한 경우에는 insert를 더 많이 넣기도 한다. * Ligation된 DNA는 형질전환에 그대로 이용하는 경우가 대부분이다. 그런데 한번의 형질전환에 이용되는 DNA의 부피는 대개 10 μl이므로(2장 박테리아의 형질전환 참고) ligation의 최종부피가 너무 많으면 좋지 않다. 대개는 10~30 μl 정도로 한다. 3. 10x ligation buffer(전체부피의 1/10)와 T4 DNA ligase(1 μl)를 혼합하고 잘 섞는다. * 10x ligation 완충용액의 조성은 시약회사마다 조금씩 다르긴 하지만 대개의 경우 500 mM Tris-Cl, pH 7.8, 100 mM MgCl2, 200 mM DTT(dithiothreitol), 10 mM ATP이다. * 제조회사에서 나오는 T4 DNA ligase는 unit 수가 다르게 표시되어 있는 경우가 많다. Cohesive end ligation unit 1 unit는 0.015 Weiss unit에 해당한다. 예를들어 Poskochem enzyme은 100 cohesive end ligation unit/μl이고 Amersham enzyme은 2.5 Weiss unit/μl로 되어 있는데, 대개는 모두 반응 당 1 μl를 쓴다. 또한 enzyme에 딸려오는 buffer에는 대개 ATP가 들어있으므로 반드시 설명서를 잘 읽고 써야 한다. One-phor-all buffer를 쓸 수도 있는데, 이때는 ATP를 따로 넣어주어야 한다. 하고 싶은 말 좀 더 업그레이드하여 자료를 보완하여, 과제물을 꼼꼼하게 정성을 들어 작성했습니다. 위 자료 요약정리 잘되어 있으니 잘 참고하시어 학업에 나날이 발전이 있기를 기원합니다 ^^ 구입자 분의 앞날에 항상 무궁한 발전과 행복과 행운이 깃들기를 홧팅 키워드 실험, 경우, 몰비, 대개, 말단, 예비