레포트자료streaking&spreading 미생물학 실험에 해당하는 내용입니다

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[레포트자료]streaking&spreading 미생물학 실험에 해당하는 내용입니다..hwp

본문 제목 :내용을 입력하십시오Broth culture, streaking & spreading 과목 내용을 입력하십시오생물 공학 실험 학과 내용을 입력하십시오응용 화학 계열 L 학번 내용을 입력하십시오11971362 이름 내용을 입력하십시오이 종 선 제출날짜 내용을 입력하십시오2002. 9. 27 담당교수 내용을 입력하십시오 허 태 련 교수님 1. 실험제목 Broth culture, streaking & spreading 2. 실험원리 및 목적 식품, 토양, 생체, 그 밖의 환경에서 미생물상(microflora)을 알아보면 미생물들은 단일종으로 존재하는 것은 거의 드물고 여러 가지 종류의 미생물군이 공존하고 있음을 알게 된다. 몇 가지 종류의 미생물이 서식하며 우점종(dominant) 등을 알아보는 생태학적인 연구를 위해서는 무엇보다 먼저 서식처로부터 단일종의 미생물을 분리하는 일과 배양하는 기술이 중요하다. 실험실 내에서 인공적으로 미생물을 증식 하는 수단을 배양(culture)이라 하는데 두 종 이상의 세균이 동시에 배양될 때 혼합 배양(mixed culture)이라 하고, 혼재된 균군 중에서 원하는 균만 따로 분리하여 배양하는 것을 순수 배양(pure culture)이라 한다. 단일 종의 미생물을 분리하는 방법에는 도말평판법(streak plate method), 주입평판법 (pure plate method), 분산평판법이 있다. 본 실험에서는 streaking과 spreading 방법을 익히고, 집락이 형성된 경우 형태(form), 표면(surface), 주변(edge), 고도(elevation), 육안적 특징(optical characteristics), 및 색소생성(chromogenesis) 냄새(odor)등을 중점적으로 관찰한다. 3. 실험장치 및 기구 접종균, 고압증기멸균기(autoclave), 희석관 , 멸균된 한천사면배지(45∼50℃), 백금이, 멸균된 페트리접시, 멸균한 tip, micropipette, 멸균된 한천평판배지, 배양기, 생리식염수, 알코올 4. 실험내용 및 방법 순수배양기술(pure culture) 미생물은 널리 산재하고 있으므로 순수배양을 하기 위해서는 자연계의 혼합 미생물 군으로부터 원하는 미생물을 분리하는 것뿐만 아니라 인위적인 환경에서 다른 미생물들의 접근을 방지하여 분리한 균주와 그 후손들을 유지, 보존하는 것이 필요하다. 미생물은 생장을 위해 많은 공간을 필요로 하지 않는다. 따라서 인위적 환경은 제한된 시험관, 플라스크 혹은 페트리 접시 내에서 조성될 수 있으며, 이러한 3가지 종류의 용기가 미생물 배양에 널리 사용된다. 배양용기는 처음에 멸균(살아있는 미생물이 없어야 한다)되어야 하며, 원하는 종류의 미생물을 접종한 후에도 계속되는 외부의 오염으로부터 보호되어야 한다. 외부로부터의 오염의 주요 원인은 공기인데, 공기 중에는 항상 떠다니는 미생물들이 많다. 시험관 및 플라스크의 오염은 적당한 마개로 입구부분을 막음으로서 방지될 수 있다. 물론 배양용기의 외부 표면도 오염되기 쉬우며, 플라스크나 시험관의 내부도 물질을 집어넣거나 제거하기 위해 여는 경우에 오염될 수 있다. 이러한 위험은 마개가 제거된 후 즉시 마개를 다시 끼울 때 입구부분을 불에 통과 시킴으로써 극소화시킬 수 있다. 접종원(배양용기에 접종하기 위해 사용되는 미생물)은 보통 사용 직전에 빨리 불로 멸균한 백금 침이나 백금이를 이용하여 접종한다. 액체배양액은 피펫을 이용하여 옮길 수 있다. 이렇게 하기 위해서는 피펫의 입구 끝부분을 솜으로 막고, 사용할 때까지 내부와 외부의 오염을 방지하도록 피펫을 종이로 싸거나 유리 또는 금속용기에 넣어서 멸균시켜야 한다. 우연한 오염의 위험은 밀폐된 작은방이나 후드에서 세균을 옮겨줌으로써 더욱 감소시킬 수 있다. 이때 후드 또는 작은 방의 공기는 미생물의 함량을 감소시키기 위해 특수처리를 한다. 만일 미생물이 질병을 유발시킨다나, 재 조합 DNA기술을 이용하여 만든 생물체라면 이들의 우발적인 유출을 방지하기 위하여 특수한 후드와 다른 주의사항들이 필요하다. 평판법에 의한 순수배양의 분리 고체 배지상에 명확한 콜로니들을 형성하는 미생물들(예 : 효모, 대부분의 세균, 다수의 곰팡이와 단세포성 조류)의 순수배양은 평판법의 한 변법으로 가장 간단하게 얻을 수 있다. 이러한 방법은 한천이나 다른 적당한 응고제를 사용하여 굳힌 영양배지의 내부나 표면 위에서 개개의 생물들을 분리 하여 고착시키는 것이다. 각각의 살아 있는 미생물들은 성장하여 콜로니를 형성하며 이는 쉽게 옮겨질 수 있다. 도말평판법(streak plate) 도말평판법은 일반적으로 가장 유용한 평판법이다. 멸균한 백금이를 적당히 희석한 미생물 현탁액에 넣은 뒤 굳은 한천배지 위에 일련의 평행하고 중복되지 않는 선을 그어 도말한다. 접종원은 반복되는 도말에서 점진적으로 희석되어 처음에 도말한 부위에서는 합쳐진 상태로 자란다 하더라도 뒤에 도말한 부위에서는 잘 분리된 콜로니들이 그어진 선을 따라서 자라게 된다. 따라서 가장 중요한 장점은 각각의 콜로니 사이에 좋은 공간을 가질 수 있다는 것이다. 다음은 도말 평판하는 방법이다 ① 멸균된 페트리 접시의 밑면에 구리스 연필로 표시를 한다. ② nutrient agar(저번 실험에 제작)를 준비하여 멸균 페트리 접시에 주입하여 한천배지의 평판을 만든다. 이 때 주의해야 할 점은 한천배지를 50℃정도로 냉각하여 주입하지 않으면 페트리 접시의 뚜껑에 서린 증기가 물방울이 되어 고체배지 위로 떨어짐으로써 분리하고자 하는 콜로니를 서로 오염시킬 염려가 있다. 따라서 페트리 접시를 약간 열어둠으로써 물방울을 제거해야 한다. ③ 아래의 그림과 같이 백금이로 균체의 혼합 배양체를 접종하는 기본 조작으로 접종한다. 이때 역시 화염멸균으로 백금이를 멸균하는 것을 잊지 말아야 한다. 백금이를 멸균하는 모습 배양액 시험관 뚜껑부위 소독 배양약을 한 번 뭍힌다. ④ 아래의 그림과 같이 페트리 접시의 한천평판의 반을 도말하고 난 다음에 백금이를 불꽃으로 소독한다. 냉각된 백금이로 소독하기 전에 끝난 부분으로부터 도말을 시작하여 나머지의 한천평판 위에 연속으로 도말한다. 도말하는 모습 페트리 접시에 도말하는 방향 또는 공간 분할의 방법에라 크게 3가지로 나눌 수 있는데 그것은 다음과 같다. 4분원 도말 방법(Quadrant Streak Method) - 한천 평판의 한 모서리에 백금이로 소량의 균체를 접종시키고 그림의 1지역에서 3∼4회 도말한다. - 1지역의 도말한 끝 부분으로부터 그 지역에서 화살표의 방향으로 4회 도말한다. - 2지역에서 3지역으로 화살표의 방향대로 6∼7회 도말한다. - 백금이를 다시 멸균하고(이것은 이전에 도말 이전에 반드시 해야하는 것이다.)이어서 3지역의 끝부분에서 4지역으로 도말하되 한천평판의 나머지 전 부분을 그림처럼 도말한다. 방사 도말 방법 (Radiant Streak Method) - 소량의 균체를 한천평판의 한 주변에 4∼5회 두말한다. 이 부분을 1지역이라 한다 - 1지역의 끝으로부터 7∼8회 그 반대의 방향으로 도말한다. - 불꽃으로 소독후 위 방향과 반대 방향으로 가로질러 도말한다. 그 외의 도말 방법 - 3분원 도말 방법 : 한천 평판을 3등분하여 도말하는 방법이다. 이번에는 백금이를 세 번 멸균 하는 셈이며 접종 요령은 연속 도말의 경우와 동일하다. 3분원 도말법( T streak) - 연속도말법 : 백금이로 균체를 취하여 한천평판의 한 점에 가볍게 접종한 다음 백금이를 불꽃 으로 소독하고 다시 냉각시킨 다음 화살표의 방향대로 도말하는 방법이다. 연속적으로 구불 구불 도말하여 가는 동안에 균체는 점차로 단세포로 접종될 가능성이 있게 되며 순수 분리도 가능하게 될 것이다. 주입평판법(Pour Plat Method Loop Dilution) 백금이로 균체를 취하여 배양액에 차례로 희석하면서 접종하는 방법을 말하며, 별다른 기술을 요하지 않아도 좋은 결과를 얻을 수 있다. 이 방법의 과정은 다음과 같다. ① Nutrient agar가 담긴 시험관 세 개의 각각을 구리스 연필로 주기하고 전열판 위에서 배지를 액화한다. ② 페트리 접시에도 뚜껑혹은 밑에 주기를 해둔다. ③ 준비된 혼합 균체로부터 백금이로 1회 균체를 따서 냉각시킨 시험관에 접종한다. ④ 접종된 시험관 Ⅰ을 잘 흔들고 백금이로 시험관 Ⅰ의 접종균을 1회 따서 시험관 Ⅱ에 접종하여 흔든다. 흔들되 배양액이 솜마개에 묻을 정도가 되어서는 안 된다. 한편 시험관 Ⅰ은 50℃로 유지된 항온 수조에 넣어둔다. ⑤ 시험관 Ⅱ를 잘 흔들어 먼저의 경우와 같이 시험관Ⅲ에 접종시키고 시험관 Ⅱ를 항온 수조에 넣는다. ⑥ 시험관Ⅲ을 잘 흔들어서 Ⅲ으로 표시한 페트리 접시에 불꽃 가까이서 접종한다. 그리고 시험관 Ⅰ과 Ⅱ도 각각 표시한 페트리 접시에 접종한다. ⑦ 액체 배지가 완전히 응고된 후 도말 평판의 경우처럼 페트리 접시를 거꾸로 하여 37℃가 유지되는 항온기를 넣어 24∼48시간 배양시킨다. 주입평판법을 간단히 보여주는 그림 분산평판법 3번째 평판법의 절차는 다음과 같다. ① 세균 배양액을 희석한 ekmda 0.1ml 취하여 미리 만들어 둔 한천평판배지 표면에 접종한다. ② 삼각 유리봉을 알코올에 묻혀 불꽃 살균후, 접종액에 없는 배지 표면에 먼저 살짝 대어 식힌 후 배지 이에 접종액을 골고루 분산시킨다. ③ 배지 표면에 마른 지를 확인한 후에 펴트리접시를 뒤집어 배양기에 12∼16시간 정도 배양하여 관찰한다. 주의사항 평판배지 표면을 적당하게 건조시켜서 집락 형성이 뚜렷하게 하고, 오염된 배지는 사용하지 말아야 하며 접종중 오염에 특히 주의해야한다. 주입 평판법의 경우 시험관에 든 한천배지에 균을 접종한 후 고루고루 섞이게 하여 미생물의 고른 콜로니 형성을 돕도록 하며 또, 시험관에 든 한천배지가 굳기 전에 평판배지 위에 spreading해야 한다. 백금이는 세균을 옮길 때마다 불꽃을 달구어 사용 하도록 하고, 배지를 잘 흔들어 세균을 현탁 시킬 때 가급적 기포가 생기지 않도록 한다. 마지막으로 페트리 접시에 배지를 주입하고 나서 조심스럽게 좌우로 흔들어 배지가 페트리 접시에 고르게 퍼지도록 해야한다. 배지제 하고 싶은 말 좀 더 업그레이드하여 자료를 보완하여, 과제물을 꼼꼼하게 정성을 들어 작성했습니다. 위 자료 요약정리 잘되어 있으니 잘 참고하시어 학업에 나날이 발전이 있기를 기원합니다 ^^ 구입자 분의 앞날에 항상 무궁한 발전과 행복과 행운이 깃들기를 홧팅 키워드 미생물, 배지, 한천, 도말, 백금, 페트리